3.1 Difracţia de raze X pe cristale şi aplicaţii în biologie

În 1912, Max von Laue a sugerat că, dacă atomii dintr-un cristal formează reţele spaţiale, atunci cristalul ar trebui să se comporte ca o reţea în care au loc fenomene de difracţie similar trecerii luminii printr-o reţea de di­frac­ţie optică. Con­diţia ca un astfel de fe­nomen să ai­bă loc este ca radiaţia să aibă o lungime de undă com­parabilă cu distanţa dintre doi atomi vecini din reţea. Radiaţia X este utilizată deoarece are lungimea de undă de ordinul ång­strö­mi­lor, comparabilă cu distanţele intera­tomice din cristale. Dispozitivul experimental utilizat în realizarea difracţiei de raze X (fig. 6) utilizează un tub de raze X şi un colimator prin care este transmis fasciculul de radi­a­ţii X pe un cristal, de exemplu, de NaCl. Figura de difracţie ob­ţi­nu­tă poate fi detectată pe un film fotografic, dând naştere unor spoturi de difracţie cunoscute drept spoturi Laue.

Conform figurii, fascicolul de radiaţie X poate fi reflectat de planuri cristaline duiferite. Dacă radiaţia X este incidentă la un astfel de plan sub un unghi J, atunci diferenţa de drum parcursă de razele refractate de două planuri cristaline învecinate va fi 2dsinJ, unde d este distanţa dintre planuri. Pentru a se obţine un maxim de difracţie se pune condiţia:

2dsinJ = ml,            unde m =1,2,3,…                   (5)

relaţia (5) se numeşte condiţia lui Bragg.

Fig. 6. Schema de principiu a sistemului de difracţie de raze X(a), diagrama difracţiei (b) figura de difracţie (c) şi instalaţie de difracţie de raze X (d).

Determinarea structurii tridimensionale a proteinelor cu difracţie de raze X

Cristalizarea - Pentru a realiza difracţia de raze X pe macromolecule biologice este necesară cristalizarea cestora. Cristalizarea se realizează utilizând o soluţie a materialului biologic respectiv într-un solvent, de obicei într-o soluţie super-saturată de apă. Soluţia în care introducerea suplimentară a oricărei cantităţi de solvat nu mai produce dizolvarea acestuia este o soluţie saturată. Starea de suprasaturare se obţine prin diferite mijloace precum răcirea soluţiei saturate şi determină creşterea concentraţiei soluţiei peste valoarea de saturare.

Fig. 7. proces de cristalizare

Cristalizarea proteinelor dintr-o soluţie apoasă se produce similar celei a zahărului sau sării.  Soluţia trebuie să fie supersaturată cu solvat (proteina), pentru ca, la un moment dat să înceapă procesul de cristalizare şi creştere a cristalelor pe seama unor nuclee de cristalizare. Proteinele diferă de moleculele mici numai prin gradul de supersaturare necesar pentru inducerea cristalizării sau vitezei de cristalizare.  Pentru o soluţie saturată de proteine supersaturarea poate fi crescută pe câteva căi:

1)    răcire;

2)    evaporarea apei;

3)    adăugarea unui solvat ionic ca de exemplu sarea – prin introducerea în apă a unei sări precum clorura de sodiu (NaCL), din cauza câmpurilor electrice intense din jurul ionilor de Na+ şi Cl- un număr mare de molecule de apă vor fi legate de aceşti ioni ca urmare a structurii sale dipolare. Efectul net este reducerea numărului de molecule de apă libere să menţină proteina în soluţie şi cristalizarea acestora.;

4)    varierea pH-ului  - deoarece diferite valori ale ph-ului modifică atracţia dintre diferiţii amino acizi din care sunt constituite proteinele, aceste modificări pot induce cristalizarea.

Obţinerea datelor - Într-un cristal perfect toate moleculele au aceiaşi conformaţie şi orientare.  Se poate utiliza un dispozitv de difracţie ca cel din figura 1d. Când razele X sunt focalizate asupra cristalului format din molecule purificate, razele sunt deflectate de atomii moleculelor după anumite direcţii determinând o anumită schemă de difracţie. Numărul de electroni  din atom va determina intensitatea razelor împrăştiate.  Atomii mai grei produc o împrăştiere mai eficientă decât cei uşori.  Schemele de difracţie obţinute din diferite unghiuri vor furniza informaţii despre componentele şi distribuirea atomilor în moleculă. Informaţiile sunt culese pe difractograme (Fig.8). Tehnica este utilizată în determinarea structurii tri-dimensionale (sau terţiiare) a proteinelor crIstalizate.

Fig.8. Exemplu de difractogramă.

Pentru creşterea gradului de încredere asupra informaţiilor furnizate de măsurare se practică îngheţarea cristalelor în azot lichid.

În acest fel s-au putut determina structura a numeroase molecule biologice precum proteineele. Proteinele au la bază lanţuri polipeptidice realizate din aminoacizi legaâi unul de altul prin legături peptidice (Fig. 9)

Fig.9. Structurarea unui lanţ polipeptidic este dată prin legarea prin legături peptidice  (C ^_ N) realizate între capătul carbono^_terminal al unui aminoacid cu cel amino^_terminal al altui aminoacid. În figură este dată o secvenţă de lanţ polipeptidic format din patru amino acizi  (metionină –Met, asparagină – Asp; leucină – Leu şi tirozină – Tyr) precum şi structurile acestor amino acizi.

Proteinele sunt structuri din unul sau mai multe lanţuri polipeptidice care- conferă acesteia o anumită formă şi funcţie. În cazul structurii unei proteine pot fi identificate mai multe niveluri de structurare: primar, secundar, terţiar şi cuaternar.

Structura secundară a proteinei este definită drept conformaţia lanţului său polipeptidic.  Există două conformaţii obişnuite cele de foaie pliată-beta şi alfa helix.         

Structura terţiară a proteinei este formată de legăturile care se stabilesc între diferitele lanţuri care o compun raealizându-se astfel structura tridimensională. Această structură unică garantează proteinei o anumită funcţie. 

Structura cuaternară - uneori proteine distincte se combină într-o structură tridimensională pentru a asigura o anumită funcţie. Un astfel de exemplu este hemoglobina, proteină care transportă oxigenul în sânge. Hemoglobina este formată din patru proteine similare.

 

Fig.10. Structura primară a unei proteine este determinată de numărul şi ordinea amino acizilor din lanţul polipeptideic. O polypeptidă este o secvenţă de doi sau mai mulţi amino acizi legaţi prin legături peptidice.          

Prin difracţia de raze X s-a identificat structura a numeroase proteine ca de pildă enzima lizozim (fig. 11 )

Fig.11. Reprezentarea pe model a structurii tridimensionale a proteinei lisozim, enzimă cu rol în distrugerea peretelui celular bacterian prin hidroliza componentei polizaharidice a acestuial.  Lisozimul poate fi găsit în membrana conjuctivă a  mucoasei ce căptuşeşte cavitatea nazală umană şi canalele glandelor lacrimale. În cercetare lizozimul se extrage din albuşul de ou.